超滤离心管操作全解析：从离心参数到回收率提升的实战指南
点击次数：117 更新时间：2025-05-30
一、超滤离心管离心参数优化
转速与时间
初次离心建议以推荐转速的70%起步(如3000×g离心10分钟)，观察流速后逐级调整至4000×g，但不得超过滤膜耐受极限。
典型处理时间为10-30分钟，具体取决于截留分子量(MWCO)和样本体积。
温度控制
离心机需预冷至4℃，减少热变性吸附。低温环境可延长膜使用寿命，但需注意浓缩时间可能延长。
加速度与平衡
离心加速度调至最低档，减小对膜的压力。
确保配对的超滤管质量与重心平衡，滤芯的放置位置和方向一致，避免离心过程中晃动或损坏。
二、回收率提升策略
滤膜选择与预处理
根据目标分子量选择MWCO比目标分子小2-3倍的超滤膜。例如，目标蛋白分子量为35kDa时，选择10kDa截留分子量的超滤管。
新购超滤离心管的超滤膜含有微量甘油，使用前需用纯水或缓冲液浸泡并置于冰箱预冷10分钟。之后倒出纯水，再将超滤管置于冰上预冷2-5分钟。
样本处理与加样
样本提前用0.22μm滤膜过滤，避免颗粒物堵塞超滤膜。
将样本缓慢加入超滤管，液面不超过最大标线。加样时操作要轻，避免破坏膜结构。
浓缩与洗脱
离心过程中每5分钟暂停，用移液枪轻柔吹打截留层，防止大分子堆积形成浓差极化层。
截留体积控制在原始样本量的1/10至1/20。浓缩倍数过高易导致蛋白质聚集，可在超滤中途添加缓冲液进行置换，分阶段浓缩。
对于黏稠样本(如含甘油或蔗糖)，需降低转速10%-20%，延长离心时间。
回收操作
离心后，大分子留在上层，小分子和溶剂通过膜进入下层。外管滤液为小分子物质和溶剂；内管液体为大分子物质。
如需收集大分子物质，则另取外管，内管倒置1000×g离心1-2分钟。
三、常见问题与解决方案
漏蛋白或检测不到蛋白
原因：滤膜选择不当、离心参数不合适、样本初始浓度过低等。
解决方案：重新选择合适的MWCO滤膜，调整离心参数，确保样本初始浓度大于25μg/ml。
膜堵塞或流速过慢
原因：样本中颗粒物过多、滤膜污染等。
解决方案：样本提前过滤，定期清洗或更换滤膜。发现膜堵塞时，用0.1M NaOH浸泡1小时，再用纯水冲洗三次。
回收率低
原因：滤膜吸附性、操作不当等。
解决方案：提前用1% BSA封闭滤膜30分钟，减少非特异性吸附。操作时注意轻柔，避免破坏膜结构。
超滤后截留液出现沉淀
原因：蛋白质浓度过高、Buffer不合适等。
解决方案：用多根超滤管同时超滤，降低浓度；换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。对于沉淀，可用8M尿素溶解后再次离心。
四、维护与保养
清洗与消毒
一次性使用的超滤离心管，使用后直接丢弃。
如需重复使用，使用完的超滤管用纯水反复清洗5次，再用0.1M NaOH浸泡1-2小时，随后用20%乙醇清洗，并用超纯水或缓冲液清洗3次。一般不建议重复使用超滤管超过5次。
长期保存
短期保存：用0.1M NaOH浸泡1-2小时，纯水清洗3次，然后用75%乙醇浸泡，务必使滤膜保持湿润，不能长菌。
长期保存：用0.1M NaOH浸泡1-2小时，纯水清洗3次，然后用20%乙醇浸泡，务必使滤膜保持湿润，不能长菌。
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